测序仪使用温度（测序仪的工作原理）

本文目录一览：

• 1、小白的生信笔记(1)——高通量测序的一些基础知识
• 2、急求!!DNA测序的问题
• 3、一代测序原理及步骤
• 4、Pacbio测序(一)
• 5、测序相关知识总结
• 6、DNA测序的测序技术

小白的生信笔记(1)——高通量测序的一些基础知识

1、de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。

2、CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。

3、重复率与去重后的测序深度：高通量测序中，重复率或冗余(Duplication)指的是数据中完全相同的序列占比。若重复率是20%，那么分析时需要舍弃20%的数据。

4、随着NGS测序成本的降低，高通量测序分析变得越来越普遍。

急求!!DNA测序的问题

其次，DNA模板不能被污染，也就是说在挑菌落，细菌培养过程要防污染。如果菌生长的不好，提出来的模版测序效果也不好。 如果DNA模板的质量没问题，有一段区域总是测不通，那就要考虑模板本身存在“难通过”的结构了。

你指的应该是桑格的双脱氧测序吧，模板DNA当然是你要测序的目的片段了。

．abi prism 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。2．本实验测序pcr反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以pcr管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧pcr管盖外，最好选用pe公司的pcr管。

一代测序原理及步骤

1、一代测序仪利用Sanger测序——双脱氧末端终止法的原理，将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。

2、首先，样本通过文库构建，DNA被打断并末端处理，接着adapter连接，PCR扩增使其数量倍增。然后，这些片段在Flowcell（测序芯片）上形成簇，每个簇代表一个独特的DNA片段。

3、一代测序原理是使用Sanger测序技术，通过对DNA链延伸过程中释放的逐个核苷酸残基进行检测，获得DNA序列信息。

4、正常的NTP 3’位上有一个羟基，用以和下一个核苷酸形成磷酸二酯键，而ddNTP 2’和3’位都失去了羟基，当加入ddNTP时，链反应终止。

5、在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。

6、其原理是测序反应的核心就是利用ddNTP（由于缺少3-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力），这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。

Pacbio测序(一)

1、Sequel平台利用单分子实时测序技术，又称作SMRT（Single Molecule Real-Time）测序，其实是基于ZMW孔（零模波导孔，Zero-Mode Waveguides）的单分子读取技术，sequel无需扩增，可以可快速完成序列读取。

2、而Pacbio不是传统的建库方法，其GC bias明显小于PCR建库的illumina或Ion Torrent的测序结果。Pacbio的聚合酶可以1s钟合成3个碱基，1小时就是合成1万多个碱基。

3、PacBio SMRT技术以SMRT芯片为测序载体，应用边合成边测序的思想进行测序，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。

4、，PacBio可以直接测碱基被修饰的状态。如遇见甲基化的碱基，合成速度会放慢，光谱特征会改变。2，建库过程无需PCR，由于PCR过程中AT碱基比GC碱基复制速度快，会导致最终AT的含量比较高，影响测序质量。GC bias少。

测序相关知识总结

1、全基因组重测序 ：全基因组重测序是对基因组序列已知物种的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平进行差异性分析的方法。

2、SNP calling的精确性在8X时达到80%，而随着深度增加到30X，敏感性显著提升；同样，Indel变异的精度在8X和30X之间变化1%，但敏感性则明显随深度的提升而增强。

3、Read length 读长：单个测序reads的长度，short-read RNA测序得到的长度通常是50-150 bp。Sensitivity 敏感性：样本中多大比例的转录本会被测到，敏感性越高，这一比例越高。

4、Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。

DNA测序的测序技术

COA测序是一种DNA测序技术，它主要是指通过特定的方法对DNA进行测序。COA测序技术可以高效地获取DNA序列信息，通过对DNA序列进行分析，可以认识到许多生命现象的本质，包括基因的结构、编码方式等。

DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法与Gilbert（1977）发明的化学降解法。

二代测序又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。关于二代测序的临床应用：二代测序作为一种检测手段，主要应用于基因的生殖变异（遗传性）与体细胞变异（获得性）的检测。